Validação de qPCR: confiabilidade e qualidade nos ensaios
A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) revolucionou a análise molecular, tornando-se essencial em diagnósticos, pesquisa e controle de qualidade. Entretanto, a confiabilidade dos resultados depende diretamente de uma validação rigorosa do método, que determina se um ensaio desenvolvido, otimizado e padronizado é adequado para um propósito específico. Este processo deve equilibrar custo, risco e viabilidade técnica para garantir e documentar resultados confiáveis (WHOA, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2023).
Embora existam diretrizes e metodologias consolidadas para a validação de métodos, a maioria foi desenvolvida para análises químicas tradicionais. Para os testes moleculares, a ausência de normas específicas dificulta a padronização dos parâmetros analíticos e funcionais, pois esses ensaios apresentam características que nem sempre se ajustam aos critérios das análises clássicas. Diferentemente dos métodos químicos convencionais, a PCR baseia-se na amplificação enzimática de fragmentos específicos de DNA, envolvendo fatores físicos, biológicos e químicos que introduzem variabilidade ao processo.
A validação de metodologias em ensaios moleculares é desafiadora devido às múltiplas fontes de variação que influenciam o desempenho dos testes. Além disso, a ampla disseminação da PCR resultou em diversas interpretações e abordagens experimentais, muitas vezes comprometendo a análise dos resultados. Este cenário levou à publicação do The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments, um guia específico para a padronização e validação de ensaios qPCR aplicados ao diagnóstico clínico (BUSTIN et al., 2009).
No Brasil, o Ofício-Circular nº 6/2024/SEFAC-DTEC/CQL/CGAL/DTEC/SDA/MAPA determina que:
- Os laboratórios credenciados em diagnóstico animal deverão validar, em suas próprias instalações, os kits utilizados para ensaios de biologia molecular, independentemente da validação realizada pelos Laboratórios Federais de Defesa Agropecuária ou pelos fabricantes e que
- Durante auditorias do MAPA, será verificado se essa comprovação de desempenho foi realizada, garantindo a confiabilidade dos resultados.
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