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AGENTES VIRAIS


CAdv - Adenovírus Canino

Detecção por PCR - Reação em Cadeia da Polimerase

A hepatite infecciosa canina (HIC) e a traqueobronquite infecciosa são causadas por adenovírus canino tipo 1 (CAdV-1) e adenovírus canino tipo 2 (CAdV-2), respectivamente, membros da família Adenoviridae, gênero Mastadenovírus. Com base no tipo de CAdV encontrado, as manifestações clínicas da infecção são variáveis ​​e frequentemente inespecíficas. O CAdV-1 induz doença sistêmica e o quadro clínico associado à HIC abrange desde letargia, perda de peso e inapetência até enterite grave, hepatite, pneumonia, coagulação intravascular disseminada e morte súbita. Em contraste, o CAdV-2 se replica principalmente no epitélio respiratório, induzindo doença respiratória leve e autolimitada e, ocasionalmente, início agudo de episódios graves de tosse seca paroxística e descarga nasal, principalmente devido a coinfecções com outros patógenos respiratórios. Atualmente, o CAdV-2 é considerado um dos agentes causadores da tosse canina ou doença respiratória infecciosa canina, uma doença multifatorial induzida por vários agentes de origem viral e bacteriana. Infecções causadas por CAdV’s podem ocorrer em várias espécies de mamíferos e alta suscetibilidade é relatada em cães, coiotes, raposas vermelhas e lobos. Embora a vacinação intensiva de cães usando vírus vivo modificado CAdV-2 (de proteção cruzada) tenha reduzido marcadamente a circulação de CAdV’s pelo menos em países desenvolvidos, o ressurgimento de infecções por adenovírus em cães tem sido documentado em todo o mundo. Além disso, foram relatadas infecções por CAdV-1 severas e frequentemente fatais em espécies silvestres. Apesar da circulação mundial de ambos CAdV-1 e CAdV2, pouco tem sido feito nos últimos anos para melhorar o diagnóstico laboratorial de infecções adenovirais, que muitas vezes continua a ser indeciso e demorado, especialmente quando os métodos tradicionais são empregados. 

CAdV-1 e CAdV-2 são antigenicamente e geneticamente relacionados, apresentando 75% de identidade ao nível dos nucleótidos. Portanto, testes diagnósticos capazes de identificar rapidamente esses patógenos com alta sensibilidade e precisão exigem necessariamente métodos baseados na biologia molecular. De fato, tanto o isolamento do vírus quanto o ensaio de imunofluorescência não são capazes de discriminar entre CAdV-1 e CAdV-2. Além disso, o CAdV-2 pode ser esporadicamente detectado nos órgãos internos e nas fezes de cães vacinados ou infectados de forma aguda, enquanto o CAdV-1 frequentemente causa desconforto respiratório e é detectado nas secreções respiratórias. 

Métodos baseados em ácido nucleico são capazes de fornecer diagnóstico diferencial, com aplicação no diagnóstico clínico, onde é necessária detecção rápida e precisa de patógenos infecciosos. 



CDV - Vírus da Cinomose Canina

Detecção por qPCR - Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real

O vírus da cinomose canina (CDV) é agente etiológico de doença grave, muitas vezes fatal, em cães e muitos outros carnívoros (Appel, 1987). Embora a vacinação contra a cinomose canina tenha sido amplamente utilizada por muitas décadas, a infecção ainda representa doença importante para os cães. Os alvos de infecção são principalmente membranas mucosas e tecidos linfóides. O vírus se replica inicialmente no trato respiratório, atingindo posteriormente vários órgãos, incluindo trato gastrointestinal, os órgãos linfóides, a bexiga e o sistema nervoso central (Appel, 1987), resultando em infecção subclínica ou em combinação de sinais ou lesões respiratórias, oculares, gastrointestinais, neurológicas e cutâneas, que aparecem simultaneamente ou sequencialmente (Greene e Appel, 1998). Sinais nervosos podem estar presentes na forma crônica, juntamente com outras manifestações (Appel, 1987). O amplo espectro de sinais clínicos, também observados em outras doenças respiratórias e entéricas de cães, dificulta o diagnóstico clínico da cinomose (Jones et al., 1997) e torna necessária a confirmação laboratorial. O diagnóstico de rotina por imunofluorescência (IF) é aplicado a vários espécimes, incluindo esfregaços conjuntivais, nasais e vaginais, utilizando anticorpos policlonais ou monoclonais. Este teste não é sensível e pode detectar antígenos do vírus da cinomose canina somente dentro de 3 semanas após a infecção, quando o vírus ainda está presente nas células epiteliais (Appel, 1987). Métodos sorológicos, como ELISA e soroneutralização (SN), têm pouco valor diagnóstico, pois altos títulos de anticorpos contra o vírus da cinomose podem ser o resultado de vacinação prévia ou infecção subclínica / clínica (Shin et al., 1995; Frisk et al., 1999; Kim et al., 2001). O diagnóstico definitivo de cinomose canina pelo isolamento do vírus em células caninas é complexo e demorado (vários dias a semanas) (Shin et al., 1995; Frisk et al., 1999; Kim et al. , 2001). A natureza contagiosa e as altas taxas de mortalidade da cinomose tornam necessário acelerar o diagnóstico, a fim de quarentenar cães infectados e iniciar os tratamentos adequados precocemente. Consequentemente, um método sensível, específico e rápido é desejável para detectar mesmo pequenas quantidades de vírus no início da infecção. A Reação em Cadeia da Polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR), e mais recentemente a RTqPCR (RTPCR em Tempo Real), têm sido aplicadas com sucesso ao diagnóstico do vírus da cinomose canina (Frisk et al., 1999; von Messling et al., 1999; Rzezutka e Mizak, 2002; Saito et al., 2006 Shin et al., 2004), tornando mais fácil e ágil o controle da cinomose canina.



CPV-2 - Parvovírus Canino Tipo 2

Detecção por PCR - Reação em Cadeia da Polimerase

O parvovírus canino tipo 2 (CPV-2) é vírus que afeta cães, causando gastroenterite aguda e linfopenia em filhotes, e acredita-se que seja originário de gatos (do vírus da panleucopenia felina). É altamente contagioso,  por contato direto ou indireto com as fezes (solo infectado ou fômites que carregam o vírus). O CPV-2 foi identificado pela primeira vez em 1978, após uma epizootia de gastroenterite e miocardite ocorrendo em todo o mundo. Devido à gravidade da doença induzida por parvovírus, vários ensaios foram desenvolvidos para detectar CPV-2 nas fezes de cães infectados. Cães que desenvolvem a doença mostram sinais em 3 a 7 dias: letargia, vômito, febre e diarréia (geralmente com sangue). Infecções secundárias ocorrem como resultado do sistema imunológico enfraquecido. A forma cardíaca é menos comum e afeta filhotes infectados no útero, ou logo após o nascimento, até cerca de 8 semanas de idade.O vírus ataca o músculo cardíaco e o filhote geralmente morre repentinamente ou após um breve período de dificuldade respiratória devido a edema pulmonar. No nível microscópico, há muitos pontos de necrose do músculo cardíaco que estão associados à infiltração celular mononuclear. A formação de excesso de tecido fibroso (fibrose) é frequentemente evidente em cães sobreviventes. Ainda menos frequentemente, a doença também pode levar à infecção generalizada em recém-nascidos e causar lesões e replicação viral e ataque em outros tecidos, além dos tecidos gastrointestinais e cardíacos: cérebro, fígado, pulmões, rins e córtex adrenal. O revestimento dos vasos sanguíneos também é severamente afetado, o que leva as lesões nessa região a hemorragias. Normalmente, as fezes de cães diarréicos são rastreadas usando ensaios ELISA ou hemaglutinação (HA), mas estas técnicas são afetadas pela baixa sensibilidade. Métodos moleculares como a PCR são ensaios rápidos, sensíveis e específicos para detecção de CPV-2 em amostras clínicas.



CCoV - Coronavírus Canino 

Detecção por RTPCR - Transcrição Reversa seguida da Reação em Cadeia da Polimerase 

O coronavírus canino (CCoV) é um vírus RNA envelopado, de cadeia simples, pertencente ao grupo I da família Coronaviridae, juntamente com o vírus da gastroenterite transmissível (TGEV) de suíno, coronavírus respiratório porcino (PRCoV), vírus da diarréia epidêmica porcina (PEDV), coronavírus humano 229E (HCoV 229E) e coronavus felinos (FCoVs). O CCoV replica-se principalmente nos enterócitos das vilosidades do intestino delgado e também no epitélio do intestino grosso dos cães, causando enterite leve a grave; a eliminação viral de longo prazo, até vários meses, foi observada nas fezes de filhotes infectados. O primeiro relato sobre a infecção por CCoV ocorreu em 1971 em cães com enterite aguda. Desde então, vários surtos de CCoV têm sido relatados em todo o mundo, mostrando que o CCoV é importante enteropatógeno de cães. Investigações sorológicas e virológicas demonstraram que o CCoV é altamente prevalente em canis e abrigos de animais. A infecção do vírus entérico é caracterizada por alta morbidade e baixa mortalidade. O vírus é eliminado com altos títulos nas fezes e transmitido pela via fecal-oral. A infecção por CCoV é geralmente restrita ao trato alimentar, levando ao aparecimento de sinais clínicos típicos de gastroenterite, incluindo perda de apetite, vômitos, diarréia fluida, desidratação e, muito raramente, morte (a doença fatal ocorre como consequência de infecções mistas com parvovírus canino tipo 2 - CPV-2, com adenovírus canino tipo 1 - CAdV-1 ou com o vírus da cinomose canina - CDV. O diagnóstico de infecção pelo CCoV não pode ser feito com base em achados clínicos e post mortem, considerando que o curso de infecções causadas por outros patógenos caninos, como CPV e CAdV, pode ser indistinguível. Considerando a ampla circulação do CCoV entérico e as reações cruzadas existentes, testes sorológicos como o ensaio imunoenzimático, a neutralização do vírus e o Western blotting não são adequados para o diagnóstico de infecção por CCoV. O isolamento viral em linhagens celulares de origem canina ou felina usando homogeneizados de tecido é geralmente seguido pela detecção de antígenos virais por ensaio de imunofluorescência. No entanto, o CCoV é bastante instável no ambiente, de modo que o isolamento do vírus é bem-sucedido apenas se as amostras contiverem altos títulos virais e forem armazenadas e transportadas na cadeia fria. Em contraste, os métodos baseados na amplificação de ácido nucleico são altamente sensíveis, mesmo na presença de baixas quantidades de RNA viral. 



CPIV - Vírus Parainfluenza Canino 

Detecção por RTPCR - Transcrição Reversa seguida da Reação em Cadeia da Polimerase 

O vírus parainfluenza canino é um vírus RNA envelopado que pertence à família Paramyxoviridae. É altamente contagioso, sendo excretado do trato respiratório de animais com infecção aguda e é um componente importante do complexo de doença respiratória infecciosa canina - CDRIC. Os sinais da doença geralmente ocorrem de 2 a 8 dias após a exposição e a apresentação clínica típica é a presença de uma tosse seca que persiste por 2 a 6 dias. Descarga nasal, faringite e amigdalite também podem estar presentes, mas a febre é geralmente leve ou ausente. A disseminação viral geralmente começa de 2 a 10 dias após a exposição, geralmente antes do início dos sinais clínicos. Portanto, enquanto a síndrome clínica de CDRIC é facilmente identificável, nem todos os cães que apresentam agentes causadores apresentam sinais de infecção. O CPiV é altamente transmissível e as taxas de infecção entre indivíduos suscetíveis expostos são altas. A transmissão é predominantemente através de aerossóis infecciosos, embora o papel dos fômites possa estar subestimado. Não há estado de portador a longo prazo. A transmissão de CPiV pode ocorrer dentro de uma instalação veterinária, inclusive entre cães sem contato direto conhecido. O CPIV pode ser detectado por cultura celular, mas o método não é muito sensível. A detecção molecular de PCR é o método mais rápido, sensível e específico para identificar o vírus.





BACTÉRIAS E PROTOZOÁRIOS


Babesiose canina

Detecção por qPCR - Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real

A babesiose canina é uma doença de hemoprotozoários, comum e clinicamente significativa, transmitida por carrapatos, com distribuição mundial. Nos cães, a infecção resulta em ampla variedade de apresentações clínicas; de doença subclínica a doença grave caracterizada por febre, palidez, icterícia, esplenomegalia, fraqueza e colapso associados a hemólise intra e extravascular, lesão hipóxica, inflamação sistémica, trombocitopenia e pigmentúria. O diagnóstico de piroplasmose em cães cronicamente infectados e portadores, no entanto, continua sendo um desafio significativo devido a parasitemias muito baixas, muitas vezes intermitentes. A falha em detectar parasitas em animais com anemia hemolítica ou trombocitopenia levou a um diagnóstico incorreto em casos documentados, muitas vezes quando a suspeita clínica de babesiose também era baixa. A aplicação da PCR aumenta muito a sensibilidade e especificidade da detecção do parasita e é bem adequada para estudos epidemiológicos e filogenéticos, uma vez que a morfologia do parasita é um guia inadequado para a especiação.



Erlichiose canina

Detecção por qPCR - Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real

A erliquiose, também conhecida como pancitopenia canina tropical, febre hemorrágica canina ou tifo canino, é uma doença riquetsial causada principalmente pela Erlichia  canis. A transmissão se dá pela picada do carrapato canino marrom comum  (Rhipicephalus sanguineus) que funciona, tanto como vetor, como reservatório da  enfermidade. Outra maneira de transmissão da enfermidade, esta bem menos comum, é  por meio da transfusão sanguínea, pelo sangue infectado de um cão para outro sadio.  Após a picada pelo carrapato infectado, o período de incubação varia de 7 a 21 dias.  Os sinais clínicos são variáveis e os proprietários mais desatentos podem não perceber  o início da doença. Na fase aguda a riquetsia se replica pelas células de defesa do  organismo (células mononucleares) localizadas em linfonodos, baço e medula óssea,  resultando em aumento de volume desses órgãos. Pode ocorrer também destruição de  hemácias e plaquetas, o que causa anemia e trombocitopenia. Devido à rápida  multiplicação do agente no sangue e a vasculite generalizada que a acompanha, há  grande multiplicidade de sintomas durante o curso da enfermidade como: febre, perda  de apetite, dispnéia, manchas avermelhadas na pele (petéquias e equimoses), sinais  oftálmicos (uveíte), sinais neurológicos (convulsões, incoordenação) e poliartrite.  A fase sub-clínica geralmente é assintomática, mas podem ser encontradas algumas  complicações como depressão, hemorragias, edema de membros, perda de apetite e  palidez de mucosas. Entretanto, a fase crônica da erliquiose assume as características de  uma doença auto imune. Geralmente nesta fase o animal tem os mesmos sinais da fase  aguda porém atenuados, encontrando-se apático, caquético e com susceptibilidade  aumentada a infecções secundárias.  O diagnóstico é feito tanto através dos sinais clínicos, como pelas alterações  laboratoriais provocadas pela doença no hemograma, sendo a anemia e a  trombocitopenia as mais evidentes. Muitas vezes, durante o exame de sangue, o  patologista clínico veterinário visualiza o agente (mórulas) no interior dos  neutrófilos. O achado destas estruturas fecha o diagnóstico de maneira clara e definitiva,  mas a não observância delas não descarta a enfermidade. A PCR (reação em cadeia da  polimerase) é método de diagnóstico extremamente eficaz, já que detecta o material  genético da riquetsia no sangue do hospedeiro e é especialmente indicada nos casos de recidiva dos sinais clínicos e laboratoriais, quando se torna importante confirmar a presença do parasito para descartar outras causas  de anemia e trombocitopenia.



Leishmaniose canina

Detecção por qPCR - Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real

A leishmaniose canina é uma doença infecciosa sistêmica grave do cão causada por parasitas protozoários do gênero Leishmania. É uma zoonose com o cão considerado o principal reservatório do parasita, endêmico no Oriente Médio, América do Sul e na bacia do Mediterrâneo. As caracterticas clicas variam amplamente como consequcia dos numerosos mecanismos patogicos envolvidos no processo da doen e da diversidade das respostas imunitias exibidas na frente de Leishmania infantum por hospedeiros individuais em humanos ou outros mameros. Por essa razão, o diagnóstico é extremamente desafiador devido às manifestações clínicas diversas e inespecíficas, e devido à alta taxa de soroprevalência em cães subclínicos e assintomáticos em áreas endêmicas. Na prática clínica, o veterinário geralmente se depara com casos compatíveis ou sugestivos de leishmaniose canina, de acordo com os sintomas, e com vários testes diagnósticos, às vezes com resultados contraditórios. Como uma das características da leishmaniose é ter parasitas residuais ou latentes após o tratamento, abordagens quantitativas são necessárias não apenas para elucidar o status de cães PCR positivos em áreas endêmicas, mas também no monitoramento da parasitemia no seguimento pós-tratamento. e no novo desenvolvimento de vacinas ou testes de drogas. A detecção de PCR em tempo real está substituindo os métodos convencionais de PCR e nested PCR no diagnóstico e no acompanhamento de muitas doenças, fornecendo a capacidade de realizar medições muito sensíveis, precisas e reprodutíveis de DNA específico presente em uma amostra.